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Regeneração tecidual guiada. Utilização de uma membrana absorvível de colágeno no tratamento de defeitos ósseos angulares. – Um estudo em cães beagles

Carlos Marcelo da S. Figueredo (cmfigueredo@hotmail.com) – PhD em Periodontia e Química Clínica pelo Karolinska Institute – Suécia; – Professor Adjunto da UERJ e UNIGRANRIO; – Coordenador da Especialização em Periodontia da PUC-RJ
Ricardo Guimarães Fischer – Prof. Disciplina Periodontia da UERJ – Doutor em Periodontia pela Univ. Lünd, Suécia – Diretor Cultural da SOBRAPE – Direor da Revista PERIODONTIA, da SOBRAPE

INTRODUçãO

A reabsorção do osso alveolar, do cemento radicular e do ligamento periodontal como resultado de processos inflamatórios no periodonto é causa freqüente de mobilidade e perda dentária em adultos (Brayer et al., 1989; Löe et al., 1993).

Esta reabsorção parece ser influenciada por diversos fatores, incluindo:

capacidade imunológica do hospedeiro, susceptibilidade genética, higiene oral, e virulência dos microorganismos presentes em depósitos microbianos localizados supra e sub-gengivalmente (Haffajee et al., 1991; Hassel, 1993).

O aumento do conhecimento dos mecanismos biológicos envolvidos na cicatrização da ferida periodontal resultou no surgimento de uma modalidade de tratamento denominada Regeneração Tecidual Guiada (RTG) (Nyman et al., 1982; Karring et al., 1993).

A cicatrização que ocorre após raspagens sub-gengivais ou mesmo cirurgias baseia-se no desenvolvimento de um epitélio juncional longo, que não permite a regeneração do aparato de inserção (osso alveolar, ligamento periodontal e cemento radicular).

Tal fato poderia ser explicado pela capacidade das células do epitélio se regenerarem mais rápido do que as demais, aderindo à raíz tratada e não permitindo que células do ligamento periodontal promovam a regeneração do periodonto de inserção.

Também é sugerido que, com a inibição da migração do epitélio, células do ligamento periodontal seriam capazes de promover a regeneração das fibras conjuntivas e até neoformação de osso alveolar, cemento radicular e ligamento periodontal (Egelberg, 1987; Martin et al., 1988; Caton & Greenstein, 1993; Ripamonti & Reddi, 1994).

A técnica da RTG baseia-se na utilização de membranas biocompatíveis com a finalidade de impedir a migração imediata do epitélio para a ferida, permitindo que células do ligamento periodontal povoem a região, e criando condições para a regeneração do aparato de inserção (Gottlow, Karring & Nyman, 1990; Brägger et al., 1992).

Existem dois tipos básicos de membranas: as reabsorvíveis e as não reabsorvíveis.

A utilização de membranas não reabsorvíveis se torna pouco prático devido a necessidade de um segundo ato cirúrgico para a remoção das mesmas (Pontoriero et al., 1989). Além disso, existe o risco de contaminação da porção coronária da membrana que fica exposta à cavidade bucal (Tempro & Nalbandian, 1993).

As membranas reabsorvíveis têm merecido especial atenção, pois apresentam resultados semelhantes às não reabsorvíveis, com a vantagem de não ser necessária uma 2a intervenção cirúrgica (Greenstein & Caton, 1993; Blumenthal, 1993; Lundgren et al., 1994).

Atualmente, a técnica da RTG também tem sido empregada no tratamento de defeitos ósseos angulares em torno de implantes ósseointegrados. Apesar de poucos trabalhos terem sido publicados, existe uma grande possibilidade de que as membranas possam auxiliar no tratamento de lesões peri-implantares (Goldman, 1992; Schüpbach, Hürzeler & Grunder, 1994).

Os estudos clínicos relacionados a regeneração periodontal em humanos são promissores, principalmente os relacionados com lesões de furca grau II e defeitos intra-ósseos de três paredes (Gantes et al., 1988; Bowers et al., 1991; Flanary et al., 1991; Tonetti, Pini-Prato & Cortellini, 1995).

Porém, a grande limitação destes trabalhos é discriminar se a cicatrização está relacionada ao epitélio juncional, ao ligamento periodontal, ao osso alveolar ou ao cemento radicular. A limitação das análises histológicas em modelos humanos torna necessária a realização de estudos experimentais em animais para avaliar com mais segurança e eficácia os protocolos de reconstrução periodontal (Haney, Zimmerman & Wikesjö, 1995).

Existem vários modelos de estudo sobre RTG em animais, entre eles: defeitos supra-alveolares criados por estimulação de periodontite (Wikesjö, 1991), indução da doença por ligadura (Karring et al., 1985; Fischer, 1993), e tratamento de defeitos causados por doença periodontal natural (Caffesse et al.,1988; 1990; 1991).

Partindo do princípio de que a regeneração deve ocorrer em raízes previamente expostas a doença, os modelos baseados em defeitos causados por doença periodontal natural se tornam bastante atrativo (Haney et al., 1995). Porém, a grande maioria dos estudos experimentais em animais diretamente relacionados a RTG, tanto para membranas reabsorvíveis quanto para não reabsorvíveis, utilizam animais jovens (até 18 meses), criam defeitos ósseos artificiais e/ou induzem a doença periodontal artificialmente através de ligaduras (Gottlow et al., 1990; Selvig, Kersten & Wikesjö, 1993).

O objetivo do trabalho foi avaliar se a membrana seria capaz de (1) reduzir a profundidade da bolsa periodontal à sondagem sem provocar retração gengival. (2) impedir a migração apical do epitélio e evitar uma cicatrização por epitélio juncional longo, e (3) criar condições para a formação de um novo periodonto de inserção.

MATERIAL E MéTODOS

Foram utilizados 4 cães adultos da raça beagle, um macho e três fmeas, com idades de 7, 10, 13 e 14 anos, pesando 10, 16, 16 e 18 kg respectivamente, doados por um canil particular. Foi estipulada uma dieta padrão a base de ração (Pedigree¨), com exceção das duas semanas pós-cirúrgicas, quando foi estipulada uma dieta pastosa a base de legumes cozidos (com a intenção de evitar trauma a área operada).

Fase pré-cirúrgica (dia 0)

Para a manipulação dos c‹es, foi realizada uma pré-anestesia com acepromazina 1% (Acepran 1%¨, UNIVET) aplicando a dose de 0.1 mg/kg e anestesia geral com Thiopental sódico (Thionembutal¨, ABBOTT), dose de 12.5 mg/kg, sendo todo procedimento controlado por um médico veterinário.

Nesta fase foi dada ênfase a coleta de dados clínicos, utilizando uma sonda periodontal calibrada (sonda periodontal Hu-friedy¨, PCPUNC 15). As medidas da profundidade de bolsa à sondagem (PBS) foram aproximadas para o milímetro mais próximo.

Foram realizados os seguintes exames periodontais:

1. índice de placa (Silness & Löe, 1964). Ê

2. Sangramento à sondagem (presente ou ausente). Ê

3. Profundidade de bolsa à sondagem – medida da margem gengival ao fundo da bolsa. Ê

4. Nível de inserção à sondagem – medida da junção cemento-esmalte (JCE) ao fundo da bolsa. Ê

5. Após as medições, os animais foram submetidos a terapia básica que incluiu:

(1) raspagem supra-gengival,

(2) raspagem sub-gengival utilizando curetas Gracey 7-8, 11-12 e 13-14 (Hu-friedy¨),

(3) alisamento radicular e

(4) polimento coronário com pedra pomes.

Após os procedimentos básicos, foi estipulado um controle químico da placa bacteriana através da aplicação diária de solução de clorexidina a 0.12% (Periogard¨, Colgate) com gaze nas arcadas superior e inferior. O controle químico começou após a raspagem supra-gengival e só terminou no dia do sacrifício dos animais.

Aguardou-se um período de 30 dias após a realização da última raspagem para a realização da fase cirúrgica. No dia da cirurgia novas medições clínicas foram tomadas a fim de relatarmos os resultados clínicos obtidos apenas com a raspagem.

Fase cirúrgica (dia 30)

Trinta dias após a última raspagem sub-gengival os cães foram novamente anestesiados, seguindo a técnica descrita anteriormente. Foi selecionado 1 defeito ósseo bilateral em cada animal na face distal do P4 (4o pré-molar inferior). Um lado foi escolhido aleatoriamente para receber a membrana (lado teste), enquanto o lado contralateral foi designado como controle.

Lado teste

Foi levantado um retalho mucoperióstico expondo os defeitos ósseos que apresentaram 2-3 paredes. Após a remoção de todo tecido de granulação e complementação da raspagem em campo aberto com curetas Gracey 7-8, 11-12 e 13-14 (Hu-friedy¨), toda conformação do defeito natural ficou visível.

Membranas de colágeno bovino (Colla Tape¨, Calcitek) foram recortadas de modo a cobrirem todo defeito ósseo, tanto por vestibular quanto por lingual, como também o osso adjacente em até 3 mm.

Após adaptação da membrana ao defeito e sua estabilização junto ao coágulo (a membrana não foi suturada), suturas simples foram realizadas a fim de adaptar os bordos do retalho. As suturas foram removidas 10 dias após a cirurgia.

Lado controle

O lado contralateral foi submetido ao mesmo procedimento cirúrgico, porém sem a colocação da membrana.

Fase pós-cirúrgica (dia 30 até dia 120)

Imediatamente após a cirurgia foi administrada uma dose de Benzilpenicilina benzatina (Benzetacil¨ 400.000 UI) e fosfato dissódico de dexametasona (Decadron¨ 2.5 mg) com a intenção de evitar infecção generalizada.

Após a remoção das suturas, os cães foram mantidos sob controle químico e mecânico da placa bacteriana.

O controle químico foi feito com a utilização diária de clorexidina a 0.12% (Periogard¨, Colgate) e o controle mecânico com raspagens supra-gengivais mensais, feitas com o animal sob efeito do pré-anestésico.

Sacrifício (dia 120)

Aplicou-se a dose de 0.1 mg/kg de acepromazina 1% como medicação pré-anestésica.

Passado o período de latência, aplicou-se 12.5 mg/kg de Thiopental sódico via endo-venosa (EV) até a obtenção do plano cirúrgico.

Após os procedimentos citados, foi aplicada 1 ampola rápida de cloreto de potássio a 10% (EV).

Procedimentos Histológicos

A fixação foi feita em formol a 10% neutro (pH 7.2) tampão fosfato durante 7 dias, renovado diariamente.

A seguir, a descalcificação foi obtida através da utilização do líquido Rápido Descalcificador ósseo (RDO¨, IMUNO NIT) que promoveu descalcificação em 5-7 dias (Wu & Michaels, 1988).

As peças foram desidratadas em soluções de álcool a 50, 70, 90, e 3 vezes a 100% com tempo de permanência em cada fase de 60 minutos.

A diafanização foi feita em álcool-xilol, xilol I, xilol II e xilol III.

Logo após foi feita a imersão em parafina histológica I, II e III a 58oC, clivagem do bloco e corte no micrótomo.

A peça anatômica foi seccionada ao meio no sentido mésio-distal para que os cortes partissem do centro para a vestibular e do centro para a lingual. O posicionamento da peça permitiu cortes com espessura de 6 micrômetros.

Foi utilizada coloração padr‹o a base de hematoxilina e eosina.

Utilizamos um microscópio Olympus BH2 para fazermos a análise de 5 lâminas do lado teste e outras 5 do lado controle, a fim de realizarmos as medições histológicas.

Para as medições utilizamos um aumento de 4X num microscópio Olympus BM2 acoplado a um computador 486 DX2 66. O programa utilizado para análise histométrica foi o Image Pro Plus (Microsoft¨), que fornece uma imagem correspondente a 1/3 do campo visual do microscópio na tela do computador. A partir daí podíamos, através de medições em micrômetros, fornecer o comprimento do tecido desejado.

A seguir foram realizadas as seguintes medicões:

1 – Comprimento do defeito: distância da junção cemento-esmalte (JCE) até a base do defeito.

2 – Migração epitelial: distância da JCE até a base do epitélio juncional.

3 – Inserção conjuntiva: distância da base do epitélio juncional até crista óssea.

Analisamos também a presença de reabsorção radicular e de anquilose.

RESULTADOS

Profundidade de bolsa à sondagem (PBS)

Houve uma redução da profundidade de bolsa à sondagem durante o tratamento.

Quando comparamos as medições do dia 0 com as realizadas no dia 30, mostrando apenas os resultados obtidos com a raspagem e alisamento radicular, observamos uma redução média da PBS de 0.6 mm, tanto no lado teste quanto no lado controle.

Quando comparamos os resultados do dia da cirurgia com o dia do sacrifício, mostrando apenas o efeito da cirurgia, a redução média da PBS é de 1.7 mm para o lado teste e 0.7 mm para o lado controle.

Com relação ao dia 0 até o sacrifício, a redução média da PBS foi de 2.3 mm para o lado teste e 1.3 mm para o lado controle.

índice de placa e sangramento à sondagem

Os animais apresentavam no dia 0 índice de placa grau 3 (Silness & Löe, 1964) e sangramento abundante em todos os elementos dentários, com exceção do beagle 3 que apresentava índice de placa grau 2 e sangramento moderado (em forma de filete).

Após a terapia básica, o índice de placa foi mantido entre 0 e 1 até o dia do sacrifício e o sangramento à sondagem manteve-se ausente em todos os animais.

Nível de inserção

Os animais apresentavam a margem gengival a nível de JCE. Durante todo o experimento, os beagles 1 e 3 não apresentaram retração gengival. Sendo assim, os resultados do nível de inserção se equipararam com os resultados da PBS. A exceção foi o beagle 2, que apresentou retração gengival de 1 mm no lado controle após a cirurgia.

Tecido epitelial

Em média, a crista epitelial localizava-se a 0.4 mm coronariamente a JCE no lado teste, enquanto que, no lado controle, se localizava a nível da JCE. O comprimento epitelial era maior (2.4 mm) no lado controle do que no lado teste (1.3 mm). A migracão apical do epitélio juncional, medida feita da JCE até a base do epitélio juncional, também era maior no lado controle (2.4 mm) do que no lado teste (0.9 mm). A cicatrizacão por formacão de um epitélio juncional longo foi observada no lado controle.

Tecido conjuntivo

O comprimento do tecido conjuntivo, que corresponde a distância entre a base do epitélio juncional e a crista óssea, era de 0.9 mm no lado teste e 0.6 mm no lado controle. A distância entre a JCE e a crista óssea era menor no lado teste, sugerindo uma melhor regenerecâo do osso alveolar e ligamento periodontal, comparado ao lado controle.

Foi observada a presenca de anquilose no lado controle do beagle 1.

Nenhum sinal de reabsorcão radicular foi observado.

DISCUSSãO

O objetivo do presente estudo foi avaliar o potencial de uma membrana de colágeno bovino (Colla Tape¨, Calcitek) em produzir regeneração periodontal e impedir migração apical do epitélio. Existem 2 tipos de membranas desenvolvidas com este propósito: as não reabsorvíveis e as reabsorvíveis.

Os resultados obtidos com as membranas não reabsorvíveis são semelhantes aos obtidos com as membranas reabsorvíveis. Ambas parecem ser capazes de diminuir a migração apical do epitélio e permitir a formação de uma nova inserção (Gottlow et al., 1986; Pitaru et al., 1987; Dowell et al., 1995).

Os resultados clínicos obtidos em nosso trabalho demonstraram uma redução da profundidade de bolsa à sondagem (PBS) de 2.3 mm no lado teste contra 1.3 mm para o lado controle.

Os estudos em animais realizados por outros autores não forneceram dados clínicos (Caffesse et al., 1988, 1990; Claffey et al.,1989; Gottlow et al., 1990; Blumenthal, 1993). Sendo assim, não foi possível compará-los com nossos resultados.

Blumenthal (1993) observou que os resultados clínicos de uma membrana reabsorvível de colágeno quando comparados com uma membrana não reabsorvível eram similares. No entanto, propriedades intrínsecas e o fácil manuseio tornavam as membranas de colágeno uma boa opção para os procedimentos de RTG. E são justamente estas 2 características que estimulam a utilização das membranas de colágeno.

Com relação ao manuseio, as membranas reabsorvíveis não necessitam de uma 2a intervenção cirúrgica para sua remoção (como é o caso das membranas não reabsorvíveis), diminuindo o desconforto pós-operatório do paciente e o risco de retração gengival.

Com relação aos fatores intrínsecos, o colágeno apresenta características importantes para o processo de cicatrização, entre elas:

(1) é a macromolécula extracelular predominante no tecido conjuntivo periodontal e é fisiologicamente metabolizada por estes tecidos,

(2) tem sido demonstrado agir como quimiotático para fibroblastos (uma propriedade que pode aumentar a migração de células do ligamento periodontal para o espaço formado entre a superfície da raiz e a membrana de colágeno),

(3) tem sido demonstrado funcionar como uma barreira para migração de células epiteliais gengivais in vitro, e

(4) é hemostático (Pitaru et al., 1987).

Ripamonti & Reddi (1994) observaram que uma matriz de colágeno ósseo funciona como um ótimo substrato para o recrutamento, ancoragem de células progenitoras, e subseqüente proliferação e diferenciação em osteoblastos. Outro fator importante seria a capacidade de proteger as proteínas morfogênicas ósseas contra enzimas proteolíticas não específicas. OÊfato do componente colágeno insolúvel ser reabsorvido e eventualmente ser completamente substituído por novo osso pode ser uma vantagem adicional para sua aplicação na terapia periodontal (Ripamonti & Reddi, 1994).

Com relação a reabsorção do colágeno, os autores não relatam o tempo exato de reabsorção das membranas testadas em diversos trabalhos, porém relatam que membranas com tempo de reabsorção muito rápido (abaixo de 3 semanas) devem ser evitadas.

Assim sendo, algumas membranas de colágeno não seriam ideais para a RTG, como por exemplo: colágeno de rato (reabsorve muito rápido), Avitene (colágeno bovino microfibrilar que não é capaz de impedir a migração apical do epitélio) e membranas a base de Dura Mater (tecido a base de colágeno que além de não apresentar bons resultados, apresenta risco de transmissão da doença de Creutzfeldt-Jakkob, segundo a US food and drug Administration) (Greenstein & Caton, 1993).

Pitaru et al. (1988) observaram que a rápida degradação da porção coronária de uma membrana de colágeno pode ter favorecido uma pequena migração apical do epitélio juncional.

Blumenthal (1993) observou, através de cirurgia de reentrada, que após 4 semanas a membrana de colágeno bovino se mantinha íntegra.

Segundo os fabricantes de membranas (Colla Tape¨ e Gore-Tex¨) e os autores Greenstein & Caton (1993), o período crítico de cicatrização seria as primeiras 4 semanas. O fato da membrana testada iniciar sua reabsorção na 3a semana de uso poderia influenciar negativamente no processo de cicatrização. O principal problema que o início da reabsorção na 3a semana poderia causar ao presente experimento seria o fato de não impedir completamente a migração apical do epitélio. Os achados do presente estudo demonstraram que a membrana diminuiu a migração apical do epitélio (0.9 mm), quando comparada ao lado controle (2.4 mm).

é possível que, aumentando o tempo de reabsorção da membrana, possamos obter uma migração apical do epitélio menor do que 0.9 mm.

Com relação à inserção conjuntiva, foi observada uma faixa maior no lado teste quando comparada ao lado controle (0.9 mm e 0.6 mm respectivamente). Comparando estes resultados com o trabalho de Blumenthal (1988) em 4 beagles com defeitos ósseos de 2 paredes tratados com membranas reabsorvíveis de colágeno, observamos que o lado teste do presente trabalho apresentava uma faixa de inserção conjuntiva menor (0.9 mm contra 1.9 mm). Porém, no lado controle os resultados foram bem próximos (0.6 mm contra 0.5 mm).

Com relação a regeneração do periodonto, foi observado que a região onde se encontrava o defeito ósseo estava completamente regenerada no lado teste. O tecido presente demonstrava possuir as mesmas características do periodonto adjacente.

Anquilose foi observada no lado controle em um animal. Este achado está de acordo com Magnusson et al. (1990) que observou a presença de anquilose em apenas uma superfície no lado controle em 8 cães labrador tratados com membranas de colágeno.

Por outro lado, Claffey et al. (1989), num trabalho utilizando membranas não eabsorvíveis em 5 cães beagle, observaram a presença de anquilose tanto no lado controle quanto no lado teste.

Em contraposto, Gottlow et al. (1984) e Pitaru et al. (1988) não observaram a presença de anquilose no lado teste ou no lado controle.

Os resultados histométricos obtidos neste trabalho estão de acordo com estudos prévios (Pitaru et al., 1988; Claffey et al., 1989; Caffesse et al., 1990).

Pitaru et al. (1988) observaram através de análise histométrica em 3 cães sacrificados 1 mês após a confecção de defeitos ósseos artificiais, que o epitélio juncional apresentava-se maior no lado controle (2.1 mm) do que no lado teste (1 mm). Estes resultados estão próximos dos encontrados em nosso trabalho, que foram de 2.4 mm para o lado controle e 1.3 mm para o lado teste. O fato de apresentarmos medidas ligeiramente maiores pode ser justificada por não termos feito a diferenciação entre o epitélio juncional e o epitélio sulcular, fornecendo uma única medida.

Caffley et al. (1989) observaram que a migração apical do epitélio em 5 cães com defeitos ósseos criados cirurgicamente foi de 0.1 mm para o lado teste e de 1.3 mm para o lado controle. Os resultados encontrados em nosso experimento demonstraram uma maior migração apical do epitélio (0.9 mm para o lado teste e 2.4 mm para o controle).

Os principais argumentos que motivaram o autor a pesquisar a membrana em questão foram:

(1) sua indicação, segundo o fabricante, de proteger o coágulo sanguíneo e

(2) seu baixo custo, permitindo seu uso em larga escala.

Com relação a proteção do coágulo sanguíneo, muitos autores tem discutido sua importância para que ocorra a regeneração do periodonto (Greenstein & Caton, 1993; Blumenthal, 1993).

A função de proteção ocorreria através da formação de um “segundo retalho” localizado abaixo da sutura, produzindo uma proteção adicional ao coágulo. Esta estabilização pode ser importante para que não ocorram rupturas na interface entre os tecidos de cicatrização e a superfície radicular. A aderência contínua do coágulo e uma subseqüente granulação tecidual na superfície radicular pode ser essencial para prevenir a migração apical do epitélio juncional e não perturbar o processo de maturação da cicatrização da ferida.

Além disso, a própria criação pela membrana de um espaço abaixo do retalho, que é ocupado pelo coágulo, pode ser vantajoso em promover um crescimento de células e vasos sanguíneos oriundos da base da lesão (Magnusson et al., 1990; Claffey et al., 1989).

Com relação ao custo, devemos lembrar que a grande quantidade de pacientes necessitando de tratamento periodontal especializado não possuem recursos para financiar um tratamento regenerador. Como a membrana testada apresenta um custo baixo (U$11,00) e não representa risco sistêmico para o paciente, seria uma boa alternativa para o tratamento periodontal regenerador.

Os resultados sugerem que a membrana impede a migração apical do epitélio e permite a formação de um novo aparato de inserção.

CONCLUSõES

Apesar da pequena amostra utilizada nesse trabalho, podemos concluir que:

1 – A membrana interferiu na redução da profundidade de bolsa à sondagem, sem provocar retração gengival.

2 – A membrana testada interferiu na diminuição da migração apical do tecido epitelial, quando comparada ao lado controle.

3 – A membrana testada apresentou melhor resultado quanto ao favorecimento à formação de uma nova inserção conjuntiva, quando comparada ao lado controle.

A realização de mais pesquisas com doença natural em animais e com grupo de amostras maiores torna-se necessário para melhor esclarecermos o papel das membranas de colágeno na Regeneração Tecidual Guiada.

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O tema foi apresentado pelos autores na Conferência “Uso de uma membrana reabsorvível de colágeno no tratamento de defeitos ósseos angulares” no XIII Congresso Internacional de Odontologia do Rio de Janeiro, em julho de 1997.